ABSTRACT
S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 128 6.3.3.2.2
P . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129 6.3.3.3 Labeling by PCR. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129
6.3.3.3.1 Overview. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129 6.3.3.3.2 Protocol. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130 6.3.3.3.3 Reaction Mixture for Antigenic
Labeling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131 6.3.3.3.4 PCR Protocol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131
6.3.3.4 Labeling by 3
′
Extension . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132 6.3.3.4.1 Overview 132 6.3.3.4.2 Equipment/Reagents/Solutions. . . . . . 133 6.3.3.4.3 Protocol for Radioactive Probes . . . . . 134 6.3.3.4.4 Protocol for Antigenic Probes. . . . . . . 135
6.3.3.5 Purification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135 6.3.3.5.1 Overview. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135 6.3.3.5.2 Equipment/Reagents/Solutions . . . . . 136 6.3.3.4.3 Protocol. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136
6.3.3.6 Controls/Storage/Utilization . . . . . . . . . . . . . . . . 137 6.3.3.6.1 Checking the Labeling . . . . . . . . . . . . 137 6.3.3.6.2 Storage . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137 6.3.3.6.3 Utilization . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137
6.4 Hybridization Parameters. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138
6.4.1 Hybridization Temperature . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138 6.4.1.1 Melting Temperature (Tm) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138 6.4.1.2 The Difference between Tm and the
Hybridization Temperature . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138 6.4.2 Na
+ Ion Concentration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140
6.4.3 Hybridization Buffer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140 6.4.4 The Nature of the Probes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140 6.4.5 Probe Length . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140 6.4.6 Duration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140
6.5 Protocol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140
6.5.1 Equipment/Solutions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140 6.5.1.1 Equipment. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140 6.5.1.2 Solutions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141
6.5.2 The Reaction Medium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141 6.5.3 The Different Steps . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142
6.6 Posthybridization Treatments. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143
6.6.1 Aim . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143 6.6.2 Parameters . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143
6.6.2.1 Temperature . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144 6.6.2.2 Na
+ Ion Concentration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144
6.6.2.3 Washing Time . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144 6.6.3 Protocol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144
6.7 Before Revelation. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145
6.7.1 Radioactive Hybrids . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145 6.7.1.1 Dehydration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145 6.7.1.2 Drying . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145
6.7.2 Antigenic Labels . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145
The hybridization step in the
in situ
PCR/ RT-PCR protocol is necessary only in the indirect method, where the amplified product is present in the cells in the form of doublestranded DNA.
