ABSTRACT
DNA Polymerase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75 4.3.3.4 Criteria of Choice . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
4.4 Materials/Reagents/Solutions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
4.4.1 Thermocycler. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77 4.4.1.1 Thermocycler for PCR, Either
in Situ
or in Liquid-Phase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77 4.4.1.2 Thermocyclers for
in Situ
PCR. . . . . . . . . . . . . . . 78 4.4.1.2.1 Apparatus with Slides
Placed Vertically . . . . . . . . . . . . . . . . . 78 4.4.1.2.2 Apparatus with Slides
Placed Horizontally . . . . . . . . . . . . . . 78 4.4.2 Sealing Systems. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
4.4.2.1 The “Cover Disk/Cover Clip” System . . . . . . . . . 79 4.4.2.2 The “Easyseal” System . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
4.4.3 Reagents/Solutions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80
4.5 Protocol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80
4.5.1 Reactive Medium. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81 4.5.2 Reverse Transcription . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
4.5.2.1 Tissue Sections or Cells on Slides . . . . . . . . . . . . 81 4.5.2.1.1 Making a Hermetic
Incubation Chamber . . . . . . . . . . . . . . 81 4.5.2.1.2 Incubation Temperature . . . . . . . . . . . 85 4.5.2.1.3 Duration of Incubation . . . . . . . . . . . . 85 4.5.2.1.4 Deactivation of the Enzyme . . . . . . . . 85
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.5.2.2.1 Incubation Temperature . . . . . . . . . . . 86 4.5.2.2.2 Duration of Incubation . . . . . . . . . . . . 86 4.5.2.2.3 Deactivation of the Enzyme . . . . . . . . 86
4.5.3 Washing . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86 4.5.3.1 Tissue Sections or Cells on Slides . . . . . . . . . . . . 86 4.5.3.2 Cells in Suspension . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
Reverse transcription (RT) is an indispensable step that turns messenger RNA (mRNA) into complementary DNA (cDNA) prior to the DNA polymerase chain reaction (PCR), which specifically amplifies this newly-synthesized DNA. Thus,
in situ
RT-PCR is the most sensitive method for locating a specific, weakly expressed gene in a cell structure.
